受託サービス・特注品> Biotechnol., 33 (2015) 985-989.2. Below is an example showing what the DNA sequence for the above crRNA should look like with the PAM underlined. CRISPR/Cas9を用いた遺伝子改変は、様々な遺伝子や細胞にノックイン・ノックアウトによる変異を導入できる強力なゲノム編集技術です。CRISPR/Cas9リボ核タンパク質（RNP）システムは、プラスミドやレンチウイルスに基づく他の遺伝子編集法と比較して多くの利点を有しています。, 簡便な操作で、効果的なゲノム編集をサポートする、修飾を施した合成シングルガイドRNA（sgRNA）, *2'-O-メチル、およびホスホロチオエート修飾が、安定性と編集効率向上のために、5'および3'末端の3残基に自動的に追加されます。, HPLC精製された高純度sgRNAがオフターゲットと細胞毒性を最小限に抑え、両末端の化学修飾も施されています。, CRISPR KI テンプレートについては、こちらまでお問い合わせください。japanmarket@genscript.com, GenScript CRISPR RNA（crRNA）は36 ntの短鎖RNAオリゴヌクレオチドで、CRISPR/Cas9複合体をゲノム上の遺伝子編集標的部位に誘導する20 nt のRNAオリゴヌクレオチドを含みます。, GenScript CRISPR tracrRNAは67 ntのRNAオリゴヌクレオチドで、crRNAおよびCas9 nuclease と共に活性型CRISPR/Cas9 タンパクRNP複合体を形成します。, CRISPR/Cas9システムでは、リボ核タンパク質（RNP）複合体の細胞導入法として、直接導入、あるいはプラスミド、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスの各ベクターによる導入など、様々な様式が可能です。RNPは、Cas9タンパク質とsgRNAまたはcrRNA+tracrRNA duplexのいずれか一方で構成されています。, sgRNAまたはcrRNA : tracrRNAがCas9タンパク質と複合体を形成することにより、gRNAの20 ntシークエンスに相補するゲノムのローカス部位（PAMシークエンス[5'-NGG-3']から3-4 bp上流）を二本鎖切断する活性を有するようになります。, Cas9とsgRNA とのRNPは、Cas9とcrRNA:tracrRNAとのRNPより安定であることを示した報告がある。, CRISPR/Cas9リボ核タンパク質（RNP）複合体は、従来のプラスミドやウイルスを用いた方法と異なり、細胞内でのタンパク質発現を必要としないインタクトな複合体として細胞導入されます。このため、以下に示す多くの利点が得られます。, 最近、Cas9+sgRNAがCas9+crRNA:tracrRNAに比べて複合体として安定であり、高いゲノム編集効率が得られることを示した論文が散見されます1,2。また、これまでは、バクテリオファージRNAポリメラーゼを使用し、100 ntの合成sgRNAをin vitro転写（IVT）することが多く行われていました。これにより得られたsgRNAは5`-三リン酸を有しており、この修飾により、様々な細胞において免疫反応が誘発されるものと考えられていました。最近の研究では、実際にIVTにより産生された5’-三リン酸修飾sgRNAが、ヒトやマウスの細胞で免疫反応を誘発し、細胞毒性を引き起こすことが明らかにされています。一方、化学的に合成されたsgRNAは5’-三リン酸修飾がなく、高いゲノム編集効率を得られることが実証されています。このことから今日に至るまで、CRISPRシステムによるゲノム編集には化学合成sgRNAが最適であるとされています3。, CRISPR Ribonucleoprotein (RNP) User Manual, 実験の精度を高め、ターゲットを確実にノックアウトするには3種類のcrRNAシークエンスを用意することをお奨めします。オフターゲット効果に対する予防策としても、個別のノックアウト変異体を作製することは有効です。, プラスミドやレンチウイルスによる方法と異なり、CRISPR/Cas9 RNPはインタクトな状態で細胞に導入され、さらに細胞内での発現反応などを必要としないなど、操作が簡潔なことから多くの利点が得られます。, sgRNAでは、crRNAとtracrRNAの場合に行う複合体形成のためのアニーリング反応は必要ありません。しかし最も重要な違いは、複数の研究で明らかにされている通り、sgRNAの方がcrRNA: tracrRNA複合体よりもCas9 RNPとして安定性に優れていることです。. Methods (2013), 10(10):957-963 TracrRNA Csn2Cas9 Cas1 Cas2 Repeats Spacers Second infection RNase III 1. Contact your local US Sales Representative. © Copyright 2020 New England Biolabs. ゲノム編集> CRISPR Design Tool Genome Res. Nucleotides 1–32 is the naturally-occuring crRNA. Please sign back in to continue your session. For notes about revisions, updates, and bug fixes please see the GPP sgRNA Designer Changelog . Recently, we developed additional advancements of the original SHERLOCK technology, including multiplexing using different Cas13 or Cas12 orthologs and lateral flow readout, providing an instrument-free option for point-of-care readouts. The PAM motif should be on the 5´ end of the non-complementary DNA sequence being targeted. While this seems obvious, it is important to remember that the same is true when designing gRNAs for using CRISPR technology – the “best” gRNA depends an awful lot on what you are trying to do: gene knockout, a specific base edit, or modulation of gene expression. Benchling’s CRISPR design tool is a great resource to design knock-in experiments because it allows researchers to design guide RNAs and templates in one place, quickly and securely. HOME> ゲノム編集> We recommend using 20 nt upstream of the PAM site in the forward orientation as your crRNA protospacer sequence.